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干细胞抗衰老、广西干细胞、济南赛尔生物(多图)

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最后更新2017-02-22 00:13:02
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干细胞抗衰老、广西干细胞、济南赛尔生物(多图)
一、DC-CIK细胞培养方法 1.将采集的外周血收集到2支离心管中,2000r/min离心5min,弃上清,将沉淀细胞混合,到加生理盐水至25mL,使沉淀细胞充分悬浮。另取1支离心管,加入淋巴细胞分离液20mL,用滴管将血细胞悬液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面,使二者之间形成清晰的界面。 2.2000r/min离心20min后,从管底到液面分为4层,依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外周血单个核细胞层(PBMC层)、血浆层。用吸管将PBMC层吸出,转移至另一支离心管中。 3.加生理盐水至40mL,1500r/min离心5min,结束后弃上清,将沉淀细胞悬浮,加入生理盐水至40mL,充分混匀后,1500r/min离心5min。如此共离心洗涤3次。 4.最后一次离心结束后,弃上清,将沉淀细胞均分为3份,分别转移到3个培养瓶中,各加入40mL的免疫细胞无血清培养液培养,分别记为A1、A2、A3。 5.2h后取出培养的细胞,分别将A1、A2和A3中悬浮的淋巴细胞转移至另3个培养瓶中,分别记为B1、B2、B3。3个B瓶中加入IFN-γ,第二天加入IC因子(含有IL-2和抗CD3单抗),诱导培养CIK;3个含有贴壁细胞的A瓶中各加入40mL的免疫细胞无血清培养液和H1、Hb因子,诱导培养DC。 6.DC培养过程中,如有发黄,则换液,补加H1和Hb因子。 7.CIK培养过程中,如发现培养液发黄,则换液,换液后补加IL-2。如发现有细胞团块结为不良絮状,则用离心管收集后静置沉降5min左右,待絮状物沉淀后,小心将上清细胞悬液倒回培养瓶中。 8.DC于第7天加入肿瘤抗原和TNF,第8天铲下收集后与相应的CIK混合共培养。DC瓶弃去。如果总的细胞量过于庞大,也可将DC和CIK混合后均分到A和B瓶中。 9.共培养的DC-CIK于第10天做微生物检测。 10.细胞悬浮液的制备:培养结束后,将培养瓶中的细胞悬液用离心管收集,1500r/min,5min离心洗涤3次,将25毫升白蛋白加入250ml盐水中,终浓度1%,加入细胞沉淀,配成细胞悬液。 4.能够杀灭多种肿瘤。 CIK细胞经常被称作具有NK特性的T淋巴细胞,既具有T细胞的杀灭能力同时还具备NK细胞的非MHC限制性。能够有效的杀灭多种肿瘤细胞包括NK敏感的K562细胞和NK不敏感的Hela、HL-60,人B淋巴瘤细胞系OCI—LY8等,人胃癌腹膜转移细胞株OCUM-2MD3,肝癌细胞系BEL-7402)均表现出强大的杀伤效果。 5.对正常骨髓造血前体细胞的毒性。 科学家研究认为CIK细胞对正常骨髓细胞毒性较小,可以保存75%以上的CFU-GM 集落。CIK细胞对正常骨髓的抑制可能与CIK细胞产生肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、淋巴细胞毒素等细胞因子有关。 6.CIK细胞能够抵抗Fas介导的凋亡。 肿瘤细胞能够表达Fas配体(FasL),这种物质能够使肿瘤细胞侵蚀掉淋巴细胞,使其能够避免被淋巴细胞杀灭也就所谓的免疫逃逸,出现这种情况会迅速的促进病情的恶化以及使肿瘤细胞转移。CIK细胞在培养时发现表面的Fas受体增加,在Fasl的存在下,CIK细胞只有少部分会参与Fas介导的凋亡,大部分细胞对Fas不会受到影响,同时也不会影响其对肿瘤的杀灭作用。CIK细胞对抗凋亡的能力在于首先CIK细胞的蛋白质合成旺盛可以抵抗凋亡;其次研究CIK细胞时发现其存在抵抗介导凋亡的基因cFLIP、Bc1-2、Bc1-XL、Survivin表达较高;再次CIK抵抗凋亡也与其细胞中的因子有着非常密切的联系;正因为CIK细胞能够有效抵抗Fas介导凋亡因此其对肿瘤的杀伤作用才会十分的有效。 三、CIK细胞生物学活性的详细分析 1.具有非常优良的体外培养特性。 根据实验人员所过的大量实验表明CIK细胞通常在加入了IFN-y、rlL-2、抗CD3McAb和IL-α等因子,就会快速的促进细胞的生长。有研究表明在培养d15,LAK细胞的增值会扩大十九倍之多,而CIK细胞的增值会扩大七十八倍,这是因为CIK细胞表面的高表达IL-2R和分泌内源性IL-2有着密不可分的关系。在培养到22天左右时,CIK细胞的生长便会达到峰值,能够增加100倍之多。 2.CIK细胞的表型分析。 科学家在体外进行CIK细胞的培养时经常能够发现在2WK之后CD3+ CD8+ 、CD3+ CD56+和CD25+ T细胞会出现明显的增加情况,分别从(33.5±10.1)%, (7.7±2.8)%和(12.3±4.5)%增加到(36.6±9.0)% (P

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